الف) آماده سازي گسترش (Smear)

نمونه هائي كه مي‌خواهند رنگ آميزي شوند را به صورت قطره (اگر مايع باشند) و غلطاندن (اگر بر روي سواب قرار دارند) بر روي يك اسلايد شيشه اي تميز و خشك قرار مي‌دهيم. اين مواد را مي‌توان در يك قطره آب مقطر استريل يا سرم فيزيولوژي استريلي كه بر روي اسلايد قرار دارد به صورت امولسيون درآورد.

• نمونه های سواب معمولا به صورت سواب رکتال و یا سواب از آبسه و چرک تهیه می شود و از نمونه های مایع هم می توان به CFS و خون اشاره کرد

از يك نمونه بيشتر نيز مي‌توان بر روي يك اسلايد گسترش تهيه نموده و رنگ‌آميزي كرد. بدين منظور با استفاده از يك مداد شمعي و يا مداد الماسي مي‌توان اسلايد را به قسمتهاي مختلفي تقسيم كرد. از آنجا كه ممكن است برخي از ارگانيسم‌ها بعد از رنگ آميزي بر روي لام زنده باشند، بايد لام‌هاي رنگ آميزي شده را پس از استفاده در ظروف حاوي مواد گندزدا انداخت.(مانند ساولن)

ب) رنگ آميزي گرم

• اين رنگ آميزي ابتدا بوسيله هانس كريستيان گرم در اواخر قرن نوزدهم كشف شد.

پس از ثابت كردن اسلايد (Fixation)، اولين مرحله رنگ آميزي گرم، اضافه نمودن كريستال ويوله است. پس از كريستال ويوله محلول يد گرم به عنوان دندانه (mordant) به رنگ قليائي كه با اتصالات شيميايي به ديواره سلولي باكتريها متصل شده، اضافه مي‌كنيم. اضافه كردن محلول رنگ بر (decolorizer) باعث تمايز سلول‌هاي گرم – مثبت و گرم – منفي مي‌گردد.

اضافه كردن رنگ مخالف (counter stain) مانند سافرانين يا كربول فوشين اين ارگانيسم‌هاي شفاف را رنگ نموده و آنها به رنگ صورتي يا قرمز در مي‌آيند. اگر چه رنگ مخالف بوسيله باكتريهاي گرم – مثبت نيز جذب مي‌شود، اما رنگ ارغواني آنها تغييري نمي‌كند.

• خلط را مي‌توان جهت مناسب بودن آن براي كشت بوسيله تخمين يا تعيين سلول‌هاي اپي تليال سنگفرشي و لكوسيت‌هاي چند هسته اي موجود در نمونه ارزيابي نمود. اگر بيشتر از 10 سلول اپي تليال در هر ميدان با بزرگنمائي پايين (100×) وجود داشته باشد. خلط با فلوراي دهاني آلوده بوده و جهت كشت مناسب نمي‌باشد. وجود چند سلول اپي تليال يا عدم وجود آنها و بيشتر از 25 لكوسيت چند هسته اي نشان دهندة يك نمونه خوب مي‌باشد.

• ادرار سانتريفوژ نشده را نيز مي‌توان جهت بررسي باكتريوري ارزشمند به روش گرم رنگ آميزي نمود. يك قطره در حدود چند ميكروليتر از ادرار خوب مخلوط شده و سانتريفوژ نشده را در سطح يك اسلايد قرار داده و اجازه مي‌دهيم تا خشك شود. وجود يك باكتري يا بيشتر در اكثر ميدانهاي روغني (1000×) نشانگر بيشتر از 100000 ميكروارگانيسم در هر ميلي ليتر ادرار مي‌باشد. گلبولهاي سفيد نيز با اين روش بايد مورد توجه قرار گيرند.

سایر رنگ امیزی ها باکتریولوژی

 رنگ آميزي اسيد – فاست (Acid – Fast staining): برای شناسایی TB (عامل بیماری سل)

رنگ آميزي متيلن بلو: نمونه مشكوك به ديفتري مورفولوژي باكتريهاي فوزيفرم و اسپيروكت را رنگ امیزی می کند .

ج)رنگ آميزيهاي افتراقي جهت انگلها 

اين رنگ آميزيها شامل رنگ آميزي تري كروم و هماتوكسيلين آهن مي‌باشد. رنگ تولوئيدين (Toluidine O) جهت حضور پنوموسيستيس كاريني به رنگ آميزي نقره جهت مشاهده ساختمان انگلها به كار مي‌رود.

د) رنگ آميزيهاي افتراقي جهت گسترش‌هاي خوني و مقاطع بافتي

انگلهائي كه در جريان خون گردش مي‌كنند را مي‌توان در داخل گلبولهاي قرمز يا پلاسما ملاحظه نمود. رنگ آميزي رايت و گيمسا به طور معمول بيشتر مورد استفاده قرار مي‌گيرند. يك قطره بزرگ خون (به اندازه يك دو ريالي) را بروي يك قسمت از اسلايدها قرار داده و با كناره يك لام ديگر آنرا حركت دوراني مي‌دهيم تا دفيبرينه شود. براي مشاهده انگلها در چنين گسترش ضخيمي گلبولهاي قرمز بايد توسط آب ليز شوند.

رنگ آميزي گيسما در موارد زير نيز كاربرد دارد:

•  مشاهده سلولهاي ويروسي يا ساير سلولهاي عفوني در نمونه‌هاي باليني مانند پايه وزيكولهاي مشكوك به هرپس.
• تراش قرنيه جهت موارد مشكوك به كونژونكتيويت كلاميديا تراكوماتيس.
• رنگ آميزي از كشت سلولي تك لايه عفوني مانند سلولهاي مك كوي از كشت كلاميديا.
• رنگ آميزي بافت تهيه شده از مغز جهت بررسي توكسوپلاسموز.
• رنگ آميزي نمونه‌هاي گرفته شده از زخم جهت بررسي ليشمانيا.

ساير رنگهائي كه جهت مقاصد ويژه استفاده مي‌شوند عبارتند از: رنگ آميزي يد جهت مشاهده انكلوزيونهاي كلاميديا در سلولهاي تك لايه آلوده، رنگ آميزي سلر (Seler's) جهت مشاهده اجسام نگري در بافت‌هاي آلوده به ويروس هاري و رنگ آميزي گيمنز (Gimenez) جهت كلاميديا ولژيونلا.

و) رنگ آميزي قارچها

عناصر قارچي را در نمونه‌هاي ثابت شده مي‌توان به چندين روش رنگ آميزي نمود. PAS (پريوديك اسيد شيف) يكي از بهترين رنگهاي عمومي است كه عناصر قارچي را در نمونه‌هاي باليني (خلط و بافت) رنگ آميزي مي‌نمايد. رنگ آميزي متن آمين سيلور (Methen amin silver) هم روش دیگری است .